Die Immunselektion bestimmt die Tumorantigenität und beeinflusst die Reaktion auf Checkpoint-Inhibitoren

Nature Genetics Band 55, Seiten 451–460 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bei Krebs selektieren evolutionäre Kräfte Klone, die sich dem Immunsystem entziehen. Hier analysierten wir mehr als 10.000 Primärtumoren und 356 mit Immun-Checkpoints behandelte Metastasen mithilfe von Immun-dN/dS, dem Verhältnis von nicht-synonymen zu synonymen Mutationen im Immunpeptidom, um die Immunselektion in Kohorten und Einzelpersonen zu messen. Wir klassifizierten Tumoren als immuneditiert, wenn antigenische Mutationen durch negative Selektion entfernt wurden, und als immunvermittelt, wenn die Antigenität durch fehlerhafte Immunmodulation verdeckt wurde. Nur bei immuneditierten Tumoren war Immunprädation mit der Infiltration von CD8-T-Zellen verbunden. Metastasen, denen das Immunsystem entkommen war, reagierten am besten auf die Immuntherapie, wohingegen immunbehandelte Patienten davon nicht profitierten, was auf einen bereits bestehenden Resistenzmechanismus hindeutet. In ähnlicher Weise entfernt die Nivolumab-Behandlung in einer Längsschnittkohorte Neoantigene ausschließlich im Immunpeptidom von nicht immuneditierten Patienten, der Gruppe mit der besten Gesamtüberlebensreaktion. Unsere Arbeit nutzt dN/dS, um zwischen immuneditierten und immungeschützten Tumoren zu unterscheiden, die potenzielle Antigenität zu messen und letztendlich dabei zu helfen, das Ansprechen auf die Behandlung vorherzusagen.

Das Immunsystem formt Tumorgenome, indem es Klone mit Neoantigen-Depletion (Immun-Editierung) oder Klone mit einer Immun-Evasion-Strategie auswählt, die eine Anreicherung von Neoantigenen ermöglicht („Immun-Escaped“)1,2,3. Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) wirken, indem sie die Immunprädation gegen bösartige Zellen reaktivieren, indem sie die „Unsichtbarkeitshülle“ entfernen, die durch die Überexpression von Immun-Checkpoint-Signalwegen wie PD1 und CTLA-4 entsteht. ICIs werden häufig zur Behandlung von Krebs eingesetzt, insbesondere bei Melanomen, wo Studien eine außergewöhnliche objektive Ansprechrate von 30 % zeigen4. Allerdings haben niedrige Ansprechraten bei einigen Tumorarten und die hochtoxischen Nebenwirkungen kostspieliger ICI-Behandlungen die Suche nach besser prädiktiven Biomarkern vorangetrieben. Bisher sind die von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassenen Biomarker Tumormutationslast (TMB), Mikrosatelliteninstabilität (MSI) und PDL1-Expression. TMB weist jedoch technische Einschränkungen auf, darunter eine geringe Vorhersagekraft für einige Tumoren, das Fehlen eines universellen Schwellenwerts zur Vorhersage des Ansprechens und eine starke Abhängigkeit von der Sequenzierungstechnologie und -tiefe5,6,7,8. Auch die MSI-assoziierte Reaktion und die PDL-1-Expression wurden in Frage gestellt, da mikrosatellitenstabile (MSS) und PDL-1-negative Patienten ebenfalls einen klinischen Nutzen aus der ICI-Behandlung ziehen können9,10. Da diese Metriken die zugrunde liegende Tumorentwicklungsdynamik vernachlässigen, gehen wir davon aus, dass die Stratifizierung von Patienten auf der Grundlage der Immunselektion das Patientenmanagement verbessern wird.

Eine evolutionäre Metrik11,12, die häufig zum Nachweis der Selektion in Krebsstudien verwendet wird, ist das Verhältnis von nicht-synonymen zu synonymen Mutationen, dN/dS13,14,15,16,17. dN/dS wurde verwendet, um Treibergene zu erkennen18, selektive Koeffizienten bei verschiedenen Klongrößen zu messen19 und eine positive Selektion während subklonaler Expansionen zu zeigen20,21. Da nicht-synonyme Mutationen auch Neoantigene erzeugen können, indem sie Selbstpeptide, die aufgrund der zentralen Toleranz22 keine Immunantwort auslösen, in Nicht-Selbstpeptide umwandeln, die möglicherweise eine Immunreaktion auslösen können, stellten wir die Hypothese auf, dass die Immunselektion durch Berechnung gemessen werden kann dN/dS auf dem Selbstimmunpeptidom13. Das Selbstimmunpeptidom kann als alle genomischen Regionen definiert werden, die Peptide erzeugen, die dem Immunsystem nativ über den individuellen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ausgesetzt sind. Trotz umfangreicher Literatur zur Immunselektion gegen Neoantigene23,24,25,26,27 haben nur wenige Studien die Anwendung von MHC-basierten Vorhersagen zur Erkennung der Immunselektion28 in Frage gestellt, was die wichtige Frage aufwirft, ob eine negative Selektion wirklich fehlt29, ob sie während der somatischen Evolution ineffizient ist30 oder rechnerisch erfolgt Vorhersagen über MHC-bindende Peptide sind dürftig31. Über diese Möglichkeiten hinaus bleibt der Einfluss der Immunumgehung auf Immunselektionssignale unerforscht.

Hier berechnen wir dN/dS innerhalb des Immunpeptidoms, Immun-dN/dS, um den Zusammenhang zwischen Immunselektion und T-Zell-Infiltration in primären immuneditierten Tumoren zu validieren. Wir zeigen, dass die Immunflucht die Akkumulation neutraler Neoantigene ermöglicht und letztendlich die Selektion bei Kohortenschätzungen maskiert. Wir stellen die Hypothese auf und zeigen, dass immuneditierte Tumore nicht auf Immuntherapien ansprechen, indem wir 356 mit Immuntherapie behandelte metastasierende Krebsarten analysieren. Schließlich zeigen wir in einem Längsschnittsatz ICI-behandelter metastatischer Tumoren, dass Immun-dN/dS in Kombination mit dem Escape-Status die ICI-Reaktion besser vorhersagt als klonales TMB. Unsere Studie unterstreicht die Bedeutung der Berücksichtigung der Tumorentwicklungsdynamik für die Zukunft der personalisierten Medizin.

Um die Selektion anhand genomischer Daten zu messen, haben wir SOPRANO (Selektion auf Protein-annotierten Regionen) entwickelt, einen Algorithmus, der trinukleotidkontextkorrigiertes dN/dS innerhalb (ON-Ziel oder ON-dN/dS) und außerhalb (OFF-Ziel oder OFF-dN/dS) berechnet ) jede genomische Zielregion. SOPRANO ermöglicht kohorten- und patientenspezifische dN/dS und ermöglicht Vergleiche zwischen mehreren oder einzelnen Personen (Abb. 1a). Unsere Methode verwendet Punktmutationen (Missense- und/oder verkürzte Einzelnukleotidvarianten) in Zielimmunpeptidomen, die aus (1) einem einzelnen HLA-Allel (d. h. HLA-A0201) und (2) einem Proto-HLA-Allel bestehend aus 6 HLA-Haplotypen bestehen oder (3) die spezifischen sechs HLA-Klasse-I-Allele eines Patienten (Abb. 1b). Wir haben SOPRANO in verschiedenen Umgebungen angewendet, um die Immunselektion zu quantifizieren (Abb. 1c und Tabelle 1) und die Auswirkungen der Immunumgehung zu bestimmen (Abb. 1d).

a: Schätzungen können auf Kohortenebene oder auf Einzelpersonenebene durchgeführt werden. b, In jedem Fall ist es möglich, die Immunselektion auf einem einzelnen HLA-Allel (d. h. HLA-A0201), einer generischen Kombination von HLA-Allelen (Proto-HLA) oder dem keimbahnspezifischen HLA-Immunpeptidom abzuschätzen. c: Die Immunselektion bestimmt die Evolutionsverläufe des klonalen Wachstums. Vollständig immuneditierte Tumoren mit starken Immunselektionssignalen können zu vollständig immungeschützten Tumoren übergehen, in denen keine Signale vorhanden sind. d, Spielzeugmodell der Mischung von immuneditierten und immuneliminierten Tumoren. Es ist möglich, Immun-dN/dS abzuschätzen, indem alle Mutationen aggregiert und eine einzelne Kohortenschätzung erstellt werden, oder eine Werteverteilung pro Patient abzuschätzen. In beiden Fällen gehen wir davon aus, dass die Vermischung von entkommenen Tumoren mit bearbeiteten Tumoren zum Verlust von Immunselektionssignalen führt, die sich in Immun-dN/dS-Werten widerspiegeln, die näher bei eins liegen (in der Abbildung als rote gestrichelte Linien dargestellt).

Zunächst haben wir SOPRANO auf 33 Krebsarten aus dem Krebsgenomatlas (TCGA) angewendet (Ergänzungstabellen 1 und 2 und ergänzende Abbildung 1a – c) unter Verwendung von zwei Immunpeptidomen: HLA-A0201, dem häufigsten Allel, und einem zusammengesetzten Proto-HLA28 eines der sechs häufigsten HLA-Allele (HLA-A01:01, HLA-A02:01, HLA-B07:02, HLA-B08:01, HLA-C07:01 und HLA-C07:02). Wir verwendeten das Verhältnis zwischen ON-dN/dS und OFF-dN/dS (ON/OFF), um die immunspezifische Selektion konservativ zu demonstrieren, und definierten es als Immun-dN/dS. Blasenkrebs (BLCA; 95 %-Konfidenzintervall (KI), 0,71–0,98), Lungenadenokarzinom (LUAD; 95 %-KI, 0,61–0,84), Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC; 95 %-KI, 0,70–0,98), Melanom ( SKCM; 95 %-KI, 0,75–0,92) und Uteruskorpus- und Endometriumkarzinom (UCEC; 95 %-KI, 0,85–0,98) zeigten eine signifikante nicht-synonyme Erschöpfung innerhalb des HLA-A0201-Immunpeptidoms (Abb. 2a) und Plattenepithelkarzinome im Kopf- und Halsbereich (HNSC; 95 %-KI, 0,85–0,95), zervikales Plattenepithelkarzinom (CESC; 95 %-KI, 0,88–0,99), LUAD (95 %-KI, 0,84–0,93) und LUSC (95 %-KI, 0,86–0,95) im Inneren das Proto-HLA (Abb. 2b). Die editierten Neoantigene variierten von 0 bis 151 (Ergänzungstabelle 1), wenn sie kohortenweise innerhalb des HLA-A0201-Immunpeptidoms berechnet wurden, und von 0 bis 2113, wenn sie pro Patient berechnet wurden, was darauf hindeutet, dass Kohortenschätzungen die Immunselektion auf individueller Ebene verschleiern könnten. UCEC (vier) und Darmkrebs (CRC) (zwei) waren die Tumortypen mit der höchsten Anzahl an editierten Neoantigenen pro Patient. Wir haben die Robustheit unserer Ergebnisse bestätigt, indem wir Mutationen und Individuen erneut beprobt haben (ergänzende Abbildung 1d, e) und indem wir das Immun-dN/dS mit Mutationen von verschiedenen somatischen Anrufern geschätzt haben (ergänzende Abbildung 1f). Insgesamt waren die Ergebnisse zwischen verschiedenen Anrufern konsistent und daher verwendeten wir weiterhin nur MuTect2-Aufrufe. Cholangiokarzinome, Mesotheliome und Ösophaguskarzinome wiesen ebenfalls Spuren einer Immunselektion auf, jedoch mit großen CIs aufgrund der geringen Mutationslast (ergänzende Abbildung 1c).

a,b, Immun-dN/dS (ON-dN/dS/OFF-dN/dS-Verhältnis) bei mehreren Tumortypen unter Verwendung entweder eines kuratierten HLA-A0201-basierten Immunpeptidoms (a) oder eines Proto-HLA, das aus den häufigsten HLA-Haplotypen besteht in der Bevölkerung (b). Fehlerbalken zeigen ein 95 %-Konfidenzintervall zur mit SOPRANO erhaltenen Punktschätzung an. Die Anzahl der Proben für jeden Tumortyp ist in der Ergänzungstabelle 1 beschrieben. c, Proto-HLA-Immun-dN/dS von SOPRANO im Vergleich zu zuvor berichtetem Proto-HLA-normalisiertem HBMR28. d,e, Immun-dN/dS auf HLA-A0201 (d) und HBMR auf dem Proto-HLA im Vergleich zur mittleren CD8-T-Zell-Infiltration, einschließlich Mikrosatelliten-instabiler (MSI)-reicher Tumoren (e). f,g, Immun-dN/dS auf HLA-A0201 (f) und HBMR auf dem Proto-HLA im Vergleich zur mittleren CD8-T-Zell-Infiltration, ausgenommen MSI-reiche Tumoren (g). Wir gingen davon aus, dass MSI-reiche Tumoren auch Escape-reiche Tumoren sind. P-Werte und Korrelationskoeffizienten wurden mithilfe der Pearson-Korrelation (zweiseitiger t-Test) berechnet. Grau schattierte Bereiche stellen Fehlerbänder dar, die das 95 %-Konfidenzintervall angeben. Rote gestrichelte Linien zeigen neutrales dN/dS bei eins an. h, log2 dN/dS versus -log10 (P-Wert) ausgewählter Escape-Gene (Ergänzungstabelle 3) unter Verwendung von Missense- und Trunkierungsmutationen. i, lineares gemischtes Modell mit dN/dS als abhängigen Variablen und allen Immunmetriken als unabhängigen Variablen. Die x-Achse zeigt die B-Koeffizienten. Die Modellauswahl mithilfe des AIC ergab, dass Immun-dN/dS stark mit der mittleren Häufigkeit von CD8-T-Zellen assoziiert ist. Keine Immunsubpopulation war signifikant mit OFF-dN/dS assoziiert. Für ON-dN/dS, angepasstes R2 = 0,927, F-Statistik = 18,8 bei 10 und 4 Freiheitsgraden, P = 0,00617. Für OFF-dN/dS, angepasstes R2 = 0,898, F-Statistik = 13,3 bei 10 und 4 Freiheitsgraden, P = 0,0117 (Signifikanzcodes werden als „***“ für P < 0,001, „**“ P < beschrieben 0,01, '*' P < 0,05 und NS, für nicht signifikant P > 0,05). APC, Antigen-präsentierende Zelle; FDR, Falscherkennungsrate; pDC, dendritische Plasmazelle. R gibt den Pearson-r-Korrelationskoeffizienten an.

Als nächstes verglichen wir die Kohorten-Immunselektion zwischen SOPRANO-Immun-dN/dS und einem veröffentlichten HLA-Bindungsmutationsverhältnis (HBMR)28. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen Immun-dN/dS und HBMR für das Proto-HLA (Pearson r oder r = 0,77, P = 0,00054; Abb. 2c), jedoch nicht beim Vergleich von HLA-A0201 mit dem Proto-HLA-Immunpeptidom (r = 0,37, P = 0,15; ergänzende Abbildung 1g). Die letztgenannte Korrelation war erwartungsgemäß geringer, da Proto-HLA eine größere genomische Region umfasst, in der die Immunselektion bei Patienten ohne diese HLA-Allele möglicherweise nicht wirkt. Beide Metriken verwendeten eine ähnliche Belastung durch nicht-synonyme Mutationen innerhalb (ergänzende Abbildung 1h, r = 0,93) und außerhalb des Immunpeptidoms (ergänzende Abbildung 1i, r = 0,98). Bei der Erforschung alternativer Immunpeptidome auf Basis von HLA-A0201-Patienten war die Immunselektion schwächer (Immun-dN/dS ~ 1), wenn nicht exprimierte Regionen oder schwache Bindungen einbezogen wurden, wohingegen OFF-dN/dS in beiden Fällen gleich blieb. Ein weiteres Immunpeptidom-Benchmarking ergab die stärkste Immunselektion bei Verwendung patientenspezifischer Daten (ergänzende Abbildung 2). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass es aufgrund unterschiedlicher Immunpeptidome zu Diskrepanzen bei der Immunselektion kommen kann, insbesondere wenn nicht exprimierte oder falsche MHC-bindende Peptide einbezogen werden.

Wir stellten die Hypothese auf, dass eine schwache Immunselektion darauf zurückzuführen ist, dass Tumoren, denen das Immunsystem entgangen ist, das Signal maskieren. Wir verglichen den Zusammenhang zwischen Immunselektion, gemessen anhand von Immun-dN/dS und HBMR, und Immuninfiltraten beim Ein- oder Ausschluss von drei Tumortypen mit einer hohen Häufigkeit von mikrosatelliteninstabilen (MSI) Fällen und daher einer hohen Häufigkeit von Umgehungsmechanismen: CRC , Magenadenokarzinom (STAD) und UCEC32. Um mögliche Verzerrungen durch Methoden zur Entfaltung großer Zellen zu minimieren, haben wir Schätzungen der Immuninfiltration aus drei verschiedenen TCGA-Studien erhalten26,33,34. Beim Vergleich aller Tumortypen mit verfügbarem HBMR korrelierte der mittlere CD8-T-Zell-Häufigkeitswert negativ mit dem Immun-dN/dS im HLA-A0201-Immunpeptidom (r = –0,7, P = 0,0035; Abb. 2d), jedoch nicht mit HBMR im Proto-HLA (r = −0,38, P = 0,16; Abb. 2e). Bei Ausschluss von CRC, STAD und UCEC erhöhte die Korrelation zwischen Immun-dN/dS und CD8-T-Zellen die Bedeutung für beide Immunpeptidome, was unsere Hypothese einer maskierenden Immunselektion durch Immunflucht stützt (HLA-A0201: r = –0,78, P = 0,0017, Abb. 2f; Proto-HLA: r = −0,61, P = 0,028, Abb. 2g). Darüber hinaus wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn alternative Immunschätzungen wie die zytolytische Aktivität (ergänzende Abbildung 3a), die CD8-T-Zell-Infiltration aus einer anderen Studie33 (ergänzende Abbildung 3b) und der Lymphozyten-Infiltrations-Score34 (ergänzende Abbildung 3c) verwendet wurden, jedoch nicht wann im Vergleich zu TMB (ergänzende Abbildung 3d). Bei der Einbeziehung aller 33 Tumortypen bestätigten wir auch, dass die Immuninfiltration mit ON-dN/dS und Immun-dN/dS korrelierte, nicht jedoch mit OFF-dN/dS (ergänzende Abbildung 4a – c).

Anschließend führen wir SOPRANO auf einer Untergruppe von 6.858 primären unbehandelten Tumoren aus TCGA mit mindestens einer einzelnen Mutation im Immunpeptidom unter Verwendung der sechs HLA-Allele jedes Patienten durch und klassifizieren jedes Individuum basierend darauf in entkommene (escaped+) oder nicht entkommene (escaped−). eine Missense- oder eine abschneidende Mutation in einem vorab ausgewählten „Escape“-Gen, das mit der Antigen-präsentierenden Maschinerie assoziiert ist (Ergänzungstabellen 3–5). Unter 88 vorselektierten Escape-Genen fanden wir eine signifikante positive Selektion bei Missense-Mutationen in 40 Genen, darunter HLA-B-, B2M-, IFNG- und KIR-ähnlichen Genen, sowie bei verkürzten Mutationen in acht Genen, darunter B2M, HLA-A, B und C (Abb. 2h und Ergänzungstabelle 6). Als nächstes verglichen wir Immun-dN/dS und Mutationslast zwischen Fluchtschichten für verschiedene Immunkategorien34. Obwohl patientenspezifisches Immun-dN/dS und CD8-T-Zell-Infiltration nicht korrelierten, fanden wir in allen Kategorien einen signifikant höheren TMB bei entkommenen+ Tumoren (ergänzende Abbildung 4d), während das Immun-dN/dS bei entkommenen+ Tumoren in C1 und C2 signifikant höher war Kategorien, gekennzeichnet durch hohe Proliferation und hohe intratumorale Heterogenität, und unterschieden sich nicht in C3, gekennzeichnet durch geringe Proliferation, und C4, gekennzeichnet durch Abwesenheit von Lymphozyten (ergänzende Abbildung 4e). Darüber hinaus enthielt Escaped+ mehr Spleiß-, Stop-Loss- und Nonsense-Mutationen (ergänzende Abbildung 5a) und mehr Amplifikationen und Deletionen (Daten aus einer früheren Studie 35; ergänzende Abbildung 5b) als entkommene − Tumoren. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen dem Immun-dN/dS-Abstand zur Neutralität und TMB bei entkommenen Tumoren (P = 2,4e-12), jedoch nicht bei entkommenen Tumoren (ergänzende Abbildung 5c), was die Hypothese stützt, dass neoantigene Mutationen in entkommenen Tumoren neutral auftreten. Interessanterweise wurde ein solcher Effekt nicht beobachtet, wenn Deletionen oder Amplifikationen in Escape-Genen berücksichtigt wurden (ergänzende Abbildung 5d). Wichtig ist, dass der Anstieg der Mutationslast speziell auf Missense- oder Trunkierungsmutationen zurückzuführen war und nicht auf synonyme Ereignisse auf denselben Escape-Genen (ergänzende Abbildung 6).

Um zu bestimmen, welche Immunsubpopulationen mit der Immunselektion assoziiert waren, verwendeten wir ein lineares gemischtes Modell, um ihren Beitrag zu Immun-, ON- und OFF-dN/dS zu bestimmen, einschließlich (ergänzende Abbildung 7a) oder ohne CRC, STAD und UCEC (Abb . 2i). Das leistungsstärkste Modell zur Vorhersage von Immun-dN/dS (R2adj = 0,89, Akaike-Informationskriterium (AIC) = −83, P = 0,01) hatte CD8-T-Zellen als signifikanteste erklärende Variable. Wichtig ist, dass keine Variable OFF-dN/dS erklären konnte und sieben von zehn getesteten Immunvariablen signifikant mit ON-dN/dS assoziiert waren. Darüber hinaus fanden wir bei der Ausweitung auf weitere Tumortypen mit verfügbaren Immunzell-Scores einen signifikanten Zusammenhang zwischen Immun-dN/dS und Leukozyteninfiltration in entkommenen − Tumoren (Ergänzende Abbildung 7b, keine verkürzten Mutationen: P = 0,007; Ergänzende Abbildung 7c, kein Missense/Kürzung: P = 0,011), aber nicht in entkommenen+ Tumoren (Ergänzende Abbildung 7d, Missense/Kürzung: P = 0,58; Ergänzende Abbildung 7e, Kürzung: P = 0,25). Diese Ergebnisse wurden in einem multivariaten Modell bestätigt, bei dem die Stromafraktion kontrolliert wurde (ergänzende Abbildung 7f) oder mehrere andere Zellzustände einbezogen wurden (ergänzende Abbildung 7g). Interessanterweise war die PD1- und PDL1-Expression in einer univariaten Analyse mit der Immunselektion verbunden (ergänzende Abbildung 7h, i PD1 P = 0,021, PDL1 P = 0,057), jedoch nicht in einem linearen gemischten Modell, das CD8-T-Zellen umfasste (ergänzende Abbildung 7j). ,k), was CD8-T-Zell-Lymphozyten als Haupttreiber der Immunselektion hervorhebt.

Um die genetischen Unterschiede zwischen entkommenen und bearbeiteten Tumoren weiter zu charakterisieren, konzentrierten wir uns auf 879 zuvor kuratierte primäre unbehandelte CRC, STAD und UCEC32. Diese Tumoren verfügten über mehrere annotierte Escape-Mechanismen, einschließlich einer durch RNA-Sequenzierung abgeleiteten Immun-Checkpoint-Hemmung, Verlust der Heterozygotie von HLA-Genen und Kopienzahlstatus (CN) für Escape-Gene (ergänzende Abbildung 8). Bei allen drei Tumortypen waren TMB (ergänzende Abbildung 9a) und Immun-dN/dS (ergänzende Abbildung 9b) bei MSI- und PolE-mutierten (POLE)-Subtypen im Vergleich zu MSS-Tumoren signifikant höher. Bei der Stratifizierung nach Escape-Status hatten entkommene+ Tumoren einen signifikant höheren TMB als entkommene− Tumoren (MSS: P = 0,0018 und MSI: P = 0,00027, Abb. 3a) und einen Immun-dN/dS, der näher bei eins lag (Abb. 3b), was darauf hindeutet dass sich die meisten Mutationen nach der Flucht neutral ansammeln.

Analyse einer kuratierten Gruppe von Individuen aus drei MSI-reichen Tumortypen. Patientenspezifische Analyse von primärem unbehandeltem Darmkrebs (CRC), Magenkrebs (STAD) und Gebärmutter-/Endometriumkrebs (UCEC) (n = 879) mit kommentierten Fluchtmechanismen, erhalten von Lakatos et al.32. a,b, TMB (a) und Immun-dN/dS (b) für verschiedene Subtypen von Krebsarten, einschließlich MSS-Escaped− (MSS−, n = 130) und Escaped+ (MSS+, n = 144), Mikrosatelliten-instabiles Escaped− ( MSI−, n = 53) und Escaped+ (MSI+, n = 125) und POLE-Mutanten (n = 38). c, Immun-dN/dS versus TMB für immun-escaped und immun-editierte MSS-Gruppen unter Verwendung aller Mutationen (MSS − n = 107, MSS + n = 133). d, Immun-dN/dS-Vergleich zwischen entkommenen − und entkommenen+ Tumoren unter Verwendung klonaler (MSS−, n = 93, MSS+, n = 94) oder aller Mutationen (MSS−, n = 130, MSS+, n = 144). e, Immun-dN/dS-Vergleich zwischen klonalen und allen Mutationen in entkommenen − und entkommenen + MSS-Tumoren. Gemeldete P-Werte aus gepaarten zweiseitigen Wilcoxon-Rangtests mit zwei Stichproben nach mehrfacher Testkorrektur mit der Holm-Methode. f, Zusammenhang zwischen Immun-dN/dS und der gemeldeten CD8-T-Zell-Infiltration für Escaped− und Escaped+ in MSS- und MSI-Tumoren. Boxplots stellen den Median, das 25. Perzentil und das 75. Perzentil dar, und Whiskers entsprechen dem 1,5-fachen Interquartilbereich. CRC, Kreis; STAD, Dreieck; UCEC, quadratisch. Für Vergleiche mit zwei Stichproben wurden die P-Werte mithilfe eines nichtparametrischen zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests berechnet. Für lineare Korrelationen wurden P-Werte und Koeffizienten mithilfe der Pearson-Korrelation (zweiseitiger t-Test) berechnet. Rote gestrichelte Linien zeigen immunneutrales dN/dS = 1 an.

Um zu testen, ob sich Antigenmutationen nach der Flucht neutral „immun“ ansammeln (fehlende Immunselektion), verglichen wir die Mutationslast und das Immun-dN/dS. Tatsächlich korrelierten TMB und Immun-dN/dS nur bei MSS-escaped+-Tumoren signifikant (P = 0,0001; Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass die Immunselektion bei MSS-escaped−-Patienten immer noch aktiv war. Um auszuschließen, dass diese Assoziation durch entkommene Tumoren mit hohem TMB-Gehalt verursacht wurde, schließen wir Personen mit einer Mutationslast über dem maximalen TMB aus, das bei entkommenen MSS-Tumoren beobachtet wurde, und bestätigten die Korrelation unter Berücksichtigung aller Mutationen (P = 0, 0092; ergänzende Abbildung 9c) und klonal Mutationen (P = 0, 032; ergänzende Abb. 9d). Die Immunselektion war bei entkommenen + oder entkommenen MSI / POLE-Tumoren nicht mit TMB assoziiert (ergänzende Abbildung 9e). Dieser Befund lässt darauf schließen, dass sich bei diesen Tumorsubtypen Umgehungsmechanismen in einem frühen Stadium der Karzinogenese entwickeln, was dazu führt, dass Tumore immunneutral und stark antigen sind und daher möglicherweise besser auf Immuntherapien ansprechen. Tatsächlich ist bekannt, dass Patienten mit MSI- oder POLE-Subtypen die besten klinischen Ansprechraten auf Checkpoint-Inhibitoren haben36. Wir haben diese Ergebnisse durch die Verwendung von mindestens drei synonymen Mutationen im Immunpeptidom bestätigt, um das Risiko zu minimieren, dass Patienten fälschlicherweise als bearbeitet eingestuft wurden (P = 2,8 × 10–5; ergänzende Abbildung 9f).

Als nächstes fragten wir, ob bei MSS-Tumoren klonale Mutationen Immunselektionssignale enthalten, subklonale Mutationen dagegen nicht, da sie sich frei ansammeln können, wenn Fluchtmechanismen vorhanden sind. Der klonale Immun-dN/dS war ähnlich niedriger als eins für MSS-escaped+ und escape-tumoren (Abb. 3d; 0,67 gegenüber 0,68 Immun-dN/dS). Unter Einbeziehung subklonaler Mutationen (d. h. aller Mutationen) hatten nur entkommene+ Tumoren einen Immun-dN/dS, der näher bei eins lag, wohingegen entkommene− Tumore Immunselektionssignale beibehielten (0,89 gegenüber 0,69, P = 0,0035; Abb. 3d). Um zu zeigen, dass dieser Effekt nicht auf Individuen mit hoher TMB aus entkommenen Tumoren zurückzuführen ist, sondern vielmehr auf subklonale Varianten zurückzuführen ist, haben wir bei jedem Patienten klonales dN/dS mit vollständig immunisiertem dN/dS verglichen. Entkommene − Tumoren hatten ein ähnliches Immun-dN/dS bei Verwendung aller oder klonaler Mutationen (alle Mutationen: 0,61 gegenüber klonalen: 0,59 Immun-dN/dS, Abb. 3e), wohingegen entkommene+ Tumoren ein signifikant höheres Immun-dN/dS aufwiesen, wenn subklonale Mutationen einbezogen wurden (0,70). versus 0,55 Immun-dN/dS, P = 1,2 × 10−4; Abb. 3e), was den zeitlichen Erwerb von immunneutralen Mutationen in entkommenen Tumoren zeigt und Hinweise auf eine anhaltende Immunselektion in entkommenen Tumoren liefert (immuneditierte Tumoren) .

Um weiter zu bestätigen, dass die Stärke der Immunselektion von der Immunüberwachung abhängt, verglichen wir das patientenspezifische Immun-dN/dS mit der CD8-T-Zell-Infiltration in entkommenen, immuneditierten Tumoren. Immun-dN/dS- und CD8-T-Zellen korrelierten in primären MSS-immuneditierten Tumoren, jedoch nicht in MSS-immuneliminierten Tumoren (P = 0,018; Abb. 3f und ergänzende Abb. 10a oder andere CD8-Metriken von Danaher et al.33 ( P = 0,011, Bonferroni α = 0,025), ergänzende Abbildung 10b), was bestätigt, dass das Immunpeptidom eine durch CD8 T-Zellen vermittelte selektive Stärke besitzt. Der Escape-Status bei MSI- und POLE-Tumoren hatte keinen Einfluss auf die Immuninfiltration, was darauf hindeutet, dass neben einem möglicherweise unbekannten Escape-Mechanismus eine hohe Mutationsrate eine schwache negative Selektion maskieren könnte, wie kürzlich vorgeschlagen30.

Um die klinische Bedeutung von Immunevasion und Immun-dN/dS als Surrogat für Tumorantigenität zu untersuchen, analysierten wir 308 Fälle von Metastasen, die einer Immuntherapie mit ICIs aus der Kohorte der Hartwig Medical Foundation unterzogen wurden37 (Abb. 4a). Die Patienten wurden vor der Behandlung sequenziert und gemäß den RECIST1.1-Richtlinien in vollständiges Ansprechen und teilweises Ansprechen sowie in progressive Erkrankung oder stabile Erkrankung eingeteilt. Es wurden 79 Responder (teilweises Ansprechen und vollständiges Ansprechen) und 229 Nonresponder (fortschreitende Erkrankung/stabile Erkrankung) registriert. Wir haben das kohorten- und patientenspezifische Immun-dN/dS mithilfe des HLA-A0201-Immunpeptidoms (Abb. 4b) bzw. der sechs HLA-Allele jedes Individuums (Abb. 4c) geschätzt. Nonresponder waren im Vergleich zu Respondern für beide Immunpeptidome stark immuneditiert (immuner dN/dS < 1) (P = 0,034). Insgesamt 17 von 154 Nonrespondern hatten ein hochimmunes dN/dS (dN/dS > 2), was vermutlich auf eine positive Selektion im Immunpeptidom hindeutet (Abb. 4c). Unsere Simulationen legen jedoch nahe, dass hochimmune dN/dS-Patienten künstlich entstehen können, indem sie weniger synonyme Mutationen im Immunpeptidom tragen als der Rest der Kohorte (ergänzende Abbildung 11a), während sie insgesamt den gleichen TMB aufweisen (ergänzende Abbildung 11b). Bemerkenswerterweise blieb der Immun-dN/dS für Nonresponder signifikant niedriger als eins, wenn Personen mit weniger als zwei, drei bzw. vier synonymen Mutationen im Immunpeptidom entfernt wurden (ergänzende Abbildung 11c).

a, Insgesamt 308 Patienten mit klinischem Ansprechen auf die Immuntherapie basierend auf RECIST1.1, einschließlich Respondern (R) und Nonrespondern (NR). Die Patienten wurden primär mit Ipilimumab (Ipi), Nivolumab (Nivo), Pembrolizumab (Pembro) oder einer Kombination aus Ipilimumab plus Nivolumab (IPI/nivo) behandelt. b: Kohorten-Immun-dN/dS für Responder (n = 79) und Non-Responder (n = 229), die ein gemeinsames HLA-A0201-Immunpeptidom verwenden, zeigen einen Immun-dN/dS von weniger als 1 für Non-Responder, was mit einer niedrigen Gesamtantigenität des Tumors vereinbar ist. c, Vergleich des individuellen Immun-dN/dS für Responder (Median = 1,05, n = 67) und Nonresponder (Median = 0,77, n = 154) unter Verwendung patientenspezifischer HLA-Immunpeptidome (P = 0,034). d, Anteil der entkommenen+ (NR n = 81, R n = 48) und entkommenen − (NR n = 148, R n = 31) Tumoren, klassifiziert nach klinischem Ansprechen. Die Responder waren mit genetischen Fluchtmechanismen angereichert (χ2 P = 8 × 10−5). e, TMB für entkommene (NR+ n = 69, R+ n = 43) und entkommene Tumoren (NR− n = 85, R− n = 43), klassifiziert nach Antwortstatus, zeigen, dass entkommene+ Tumoren signifikant mehr Mutationen aufweisen als immuneditierte Tumoren . f, Patientenspezifisches Immun-dN/dS zeigte eine signifikante Depletion von nicht-synonymen Mutationen nur im Immunpeptidom von Escaped− Nonrespondern (NR−, Median = 0,69, P = 0,0012). Einseitiger vorzeichenbehafteter Wilcoxon-Rangtest bei einer Stichprobe mit mu = 1 (NR− n = 85, NR+ n = 69, R− n = 24, R+ n = 43). Boxplots stellen den Median, das 25. Perzentil und das 75. Perzentil dar, und Whiskers entsprechen dem 1,5-fachen Interquartilbereich. g, Kohorten-dN/dS für Treibergene (196 Gene von Martincorena et al.14), Escape-Gene (Ergänzungstabelle 3), das gesamte Exom (globales dN/dS) und das Immunpeptidom (immunes dN/dS). Alle Fehlerbalken umfassen die Punktschätzung plus das mit dem SOPRANO-Paket berechnete 95 %-Konfidenzintervall. h, Kaplan-Meier-Kurven des Gesamtüberlebens für Responder und Nonresponder, gruppiert nach Fluchtstatus (Log-Rang P = 1,4 × 10−6). i, Kaplan-Meier-Kurven des Gesamtüberlebens für Personen, die basierend auf Immun-dN/dS und Fluchtstatus (−, entkommen−; ​​+, entkommen+) klassifiziert wurden (Log-Rang P = 0,0025). Rote gestrichelte Linien zeigen immunneutrales dN/dS = 1 an.

Nach unserer Escape-Klassifizierung basierend auf einer Liste von Escape-Genen (ergänzende Abbildung 12) stellten wir fest, dass Responder häufiger entkommen waren als Nonresponder (Chi-Quadrat P = 8 × 10−5; Abb. 4d). Responder hatten vor der Behandlung auch einen signifikant höheren TMB als Nonresponder (ergänzende Abbildung 13a; P = 1,4 × 10−4). Bei „escaped+“-Tumoren war die TMB im Vergleich zu „escaped−“-Patienten ebenfalls signifikant höher (ergänzende Abbildung 13b; P = 2,5 × 10–18). Allerdings unterschied sich TMB innerhalb der Escaped+- und Escaped-Gruppe nicht zwischen Respondern und Nonrespondern, was darauf hindeutet, dass TMB nicht ausreicht, um das klinische Ansprechen vorherzusagen, wenn der Escape-Status berücksichtigt wird (Abb. 4e). Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Immun-dN/dS < 1 und das Fehlen von Escape auf stark immuneditierte Tumore hinweisen, die gegen Immuntherapien resistent sind. Der patientenspezifische Immun-dN/dS für Responder und Nonresponder, getrennt nach Escape-Status, war signifikant unterschiedlich (P = 0,008), und Escape-Nonresponder hatten einen Immun-dN/dS, der deutlich unter eins lag, wenn Patienten mit Null herausgefiltert wurden (Abb. 4f; P =). 0,001), eine, zwei oder drei synonyme Mutationen im Immunpeptidom (Ergänzende Abbildung 13c).

Um festzustellen, ob andere dN/dS-Metriken von unserer Stratifizierung betroffen waren, beschränkten wir unsere Kohortenschätzungen auf Treibergene (Treiber-dN/dS), Nicht-Treibergene (globale dN/dS), Escape-Gene (Escape-dN/dS) und das Immunpeptidom (immunes dN/dS) in vier Patientengruppen (Abb. 4g). Driver dN/dS war positiv für Escaped- und neutral für Escaped+-Tumoren. Escape dN/dS war höher als eins für Escaped+-Patienten und erwartungsgemäß Null für Escaped−-Patienten, da in diesen Genen keine Mutationen vorliegen. Der globale dN/dS lag erwartungsgemäß für alle Gruppen nahe bei eins, da die meisten somatischen Mutationen im Genom neutral sind14. Der Immun-dN/dS lag nur bei Nonrespondern/escaped− Tumoren unter 1, was unsere Hypothese einer primären Resistenz bei immuneditierten Patienten bestätigt.

Um die klinische Bedeutung von TMB, Escape-Status und Immun-dN/dS zu bewerten, untersuchten wir deren Einfluss auf das Gesamtüberleben bei mit ICI behandelten Patienten. Anfänglich war nur der Escape-Status signifikant mit dem klinischen Ergebnis assoziiert (univariater Cox, TMB Log-Likelihood-Ratio-Test (LRT), P = 0,51, Escape-LRT P = 0,006, Immun-dN/dS-LRT P = 1). Entflohene+-Patienten zeigten ein signifikant längeres Gesamtüberleben im Vergleich zu entkommenen−-Patienten (P = 0,0023; ergänzende Abb. 14a), insbesondere im Nonresponder-Arm (P = 1 × 10−6; Abb. 4h). Da wir zuvor eine Non-Responder-Untergruppe mit hochimmunem dN/dS beobachteten, erwarteten wir keinen linearen Zusammenhang mit dem klinischen Ergebnis. Um dies zu berücksichtigen, klassifizierten wir Patienten anhand vordefinierter Immun-dN/dS-Grenzwerte (Methoden) in immunschwache, neutrale und hohe Immunzellen und entfernten hochimmune dN/dS-Tumoren, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie genetisch entkommen (ergänzende Abbildung 14b). Unbearbeitete, entkommene+ Personen hatten ein signifikant besseres Gesamtüberleben im Vergleich zu bearbeiteten, entkommenen − Patienten (P = 0,0025; Abb. 4i), was diese Kategorien als prädiktive Marker für die ICI-Reaktion bestätigt. Um den Ausschluss von Patienten zu vermeiden und vordefinierte Grenzwerte zu verwenden, haben wir alternativ den absoluten Abstand zur Neutralität geschätzt (Delta-Immun-(D-Immun-)dN/dS). Wir haben gezeigt, dass hochimmune dN/dS-Individuen bearbeitet werden können, aber aufgrund der geringen Mutationslast einen hohen dN/dS aufweisen. In einer multivariaten Cox-Regressionsanalyse waren Escape-Status, Alter und D-Immun-dN/dS signifikant mit dem Gesamtüberleben assoziiert, wohingegen TMB keinen prognostischen Einfluss hatte (ergänzende Abbildung 14c). Wichtig ist, dass entkommene dN/dS-Individuen mit hohem d-Immunpotenzial die schlechteste Prognose hatten, wohingegen dN/dS-Individuen mit entkommenem+ niedrigem d-Immunsystem die beste Prognose hatten (ergänzende Abbildung 14d), was weiter bestätigt, dass es sich um unbearbeitete (immunneutrale) entkommene+ Tumoren handelt die besten Kandidaten für eine ICI-Behandlung. Bemerkenswerterweise blieben Escape-Status und D-Immun-dN/dS in verschiedenen multivariaten Modellen, einschließlich kürzlich veröffentlichter Metriken38 (klonales und subklonales TMB, Indel-Anzahl, CXCL9- und CD274-Expression), signifikante Faktoren (AIC 448, Log-Rang P = 1 × 10−). 6; Ergänzende Abb. 14e).

Um Immun-dN/dS als prädiktiven Biomarker für die Immuntherapie weiter zu validieren, analysierten wir eine klinisch kommentierte Längsschnittkohorte (Riaz-Kohorte) von 68 metastasierten Melanompatienten39, die vor (Prä) und während (ON) ICI-Therapie sequenziert wurden (Abb. 5a). Wir haben SOPRANO unter Verwendung jedes patientenspezifischen HLA-I-Genotyps angewendet, um Immun-dN/dS für 48 Patienten zu erhalten, die mindestens eine synonyme Mutation im Immunpeptidom aufwiesen (ergänzende Abbildung 15a). Wir verglichen den selektiven Druck, der auf das Immunpeptidom vor und während der Therapie bei Respondern (R, vollständige Responder oder teilweise Responder) und Nonrespondern (NR, stabile Erkrankung oder fortschreitende Erkrankung) wirkt. Die Behandlung reduzierte die Mutationslast (ergänzende Abbildung 15b) und das Immun-dN/dS (ergänzende Abbildung 15c) nur bei Respondern und nur innerhalb des Immunpeptidoms (ON P = 0,024, OFF P = 0,95), was eine direkt damit verbundene Verringerung des Tumorvolumens unterstützt Immunselektion (Abb. 5b).

a: Eine klinisch kommentierte Kohorte von 48 Patienten mit Sequenzierungsdaten vor (Pre) und nach (On) der ICI-Verabreichung wurde von Riaz et al.39 erhalten. b, dN/dS-Verteilungen für Nonresponder (n = 36) und Responder (n = 12) vor und nach der Therapie. Wir haben OFF-dN/dS (links), ON-dN/dS (Mitte) und Immun-dN/dS (rechts) anhand der sechs HLA-Allele jedes Patienten geschätzt. Die P-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentests berechnet und mithilfe des Benjamini-Hochberg-Tests korrigiert. c, Mutationen und ihre Prävalenz in Genen, die in der Riaz-Kohorte als entkommen eingestuft wurden. Die Personen wurden außerdem klassifiziert nach: Homozygotiestatus (Hom, homozygot; Het, heterozygot), somatischem Verlust der HLA-Heterozygotie (N, nein; Y, ja) und ihrer Immun-dN/dS-Kategorie (N, neutral; L, niedrig; H). , hoch). d, Immun-dN/dS vor der Therapie für entkommene– und entkommene+ Kohorten, klassifiziert als Responder (R) und Nonresponder (NR). Die entkommenen − Nonresponder waren die einzige Gruppe mit einem Kohorten-Immun-dN/dS von weniger als 1. Alle entkommenen+ Tumoren vor der Therapie zeigten einen Immun-dN/dS von eins. e, Immun-dN/dS-Verteilung für randomisierte entkommene Tumoren. Die Punktschätzung für Nonresponder-Escape-Patienten war signifikant niedriger als der Mittelwert der randomisierten Immun-dN/dS-Werte (genaues P = 0,019). f, Kaplan-Meier-Kurven des Gesamtüberlebens zwischen Patienten mit hohem TMB und niedrigem TMB. Patienten mit hohem TMB hatten ein signifikant längeres Gesamtüberleben (Log-Rank P = 0,031) als Personen mit niedrigem TMB. g, Kaplan-Meier-Kurven des Gesamtüberlebens zwischen immunneutralem (Escape+ und neutralem Immun-dN/dS) und immuneditiertem (Escape− und schwachem Immun-dN/dS). Der Zusammenhang zwischen Gesamtüberleben und Immun-dN/dS war signifikanter als bei TMB (Log-Rank P = 0,015). Rote gestrichelte Linien zeigen immunneutrales dN/dS = 1 an.

Als nächstes untersuchten wir, ob Immun-dN/dS die Tumorantigenität im Zusammenhang mit Reaktion und Flucht in dieser Längsschnittkohorte widerspiegelt. Wir klassifizierten Patienten anhand der Liste der Escape-Gene sowie des Verlusts der HLA-Heterozygotie und des HLA-Keimbahnstatus. Bei 30 Personen wurden insgesamt 42 der 88 Escape-Gene als mutiert befunden, wobei es sich bei den meisten Mutationen um Missense handelte; Bei fünf weiteren Patienten kam es zu einem Verlust der Heterozygotie/Homozygotie in der HLA-Region, was zu 35 entkommenen+ Patienten gegenüber 13 entkommenen − Patienten führte (Abb. 5c). Kohorten-Immun-dN/dS ergab, dass in Proben vor der Behandlung entkommene+-Patienten unabhängig von der Reaktion einen durchschnittlichen Immun-dN/dS von ~1 aufwiesen, wohingegen entkommene−-Patienten, die nicht reagierten, immuneditiert waren (Immun-dN/dS = 0,6, 95 KI). , 0,44, 0,82) (Abb. 5d). Wichtig ist, dass nur bei den Responder-Escaped+-Patienten während der Therapie eine Immun-dN/dS-Abnahme auftrat, wohingegen bei den Nonresponder-Escaped−-Patienten nach der Behandlung weiterhin Immunselektionssignale auftraten (ergänzende Abbildung 15b). Um zu kontrollieren, ob die beobachtete Immunselektion auf eine Verzerrung der Mutationslast zurückzuführen war, haben wir die gleiche Anzahl von Genen, die in der Kohorte als mutiert vorgefunden wurden, randomisiert und das Immun-dN/dS für Escaped+ und Escaped- 10.000 Mal neu berechnet. Der beobachtete Immun-dN/dS für entflohene Patienten war signifikant niedriger als die randomisierte Verteilung (Abb. 5e; exakter P = 0,019).

Um schließlich die Vorhersagekraft des Immun-dN/dS unabhängig vom Escape-Status zu testen, verglichen wir das Gesamtüberleben unter Verwendung von TMB und Immun-dN/dS vor der Therapie als unabhängige Variablen. Wie bereits in dieser Kohorte gezeigt39, zeigten Patienten mit hohem TMB ein signifikant besseres Ansprechen als Patienten mit niedrigem TMB (Log-Rank P = 0,031; Abb. 5). Wir klassifizierten die Patienten in Immun-dN/dS niedrig (Immun-dN/dS < 0,82) und neutral (Abb. 5f). Aufgrund hoher Konfidenzintervalle (ergänzende Abbildung 15e) und weniger synonymer Mutationen im Immunpeptidom (ergänzende Abbildung 15f) haben wir auch immunstarke Tumoren ausgeschlossen. Insgesamt stellten wir einen signifikanten prädiktiven Unterschied zwischen den Gruppen fest, wenn die immunstarke Gruppe einbezogen wurde (Log-Rang P = 0,026; ergänzende Abbildung 16a) oder wenn sie ausgeschlossen wurde (Log-Rang P = 0,015; Abb. 5g). Immunneutrale Tumoren zeigten die beste Reaktion und dN/dS-Tumoren mit schwachem Immunsystem hatten im Vergleich zu neutralen Tumoren das schlechteste Gesamtüberleben. Darüber hinaus war d-immunes dN/dS auch prognostisch (ergänzende Abbildung 16b). Immunneutrale Tumoren (niedriger d-immuner dN/dS) zeigten das beste Gesamtüberleben. Ein multivariates Cox-Hazard-Modell mit TMB, Escape-Status und D-Immun-dN/dS zeigte, dass immunneutrale Patienten das niedrigste Hazard-Verhältnis aufwiesen (HR = 0,25 (0,077–0,82), P = 0,023), wohingegen TMB nicht prognostisch war ( Ergänzende Abbildung 16c; HR = 0,84 (0,35–2,02), P = 0,7). Bei der Kombination der HMF- und der Riaz-Kohorte bestätigten wir, dass immuneditierte Patienten, solche mit schwachem Immun-dN/dS und ohne Escape-Mechanismen, nach einer Immuntherapie die schlechteste Prognose haben, wenn nach einem, zwei oder mindestens drei Synonymen gefiltert wurde Mutationen im Immunpeptidom (Ergänzende Abb. 16d).

Obwohl Immunediting weithin als ein von unserem Immunsystem gesteuerter evolutionärer Prozess anerkannt wird, der nach Klonen mit geringem Antigengehalt oder entkommenen Klonen selektiert, sind seine Dynamik während der Karzinogenese und das Ansprechen auf die Behandlung kaum verstanden. Im letzten Jahrzehnt galt TMB als Maß für die Immunogenität, das häufig zur Aufnahme von Patienten in eine ICI-Behandlung verwendet wird. TMB erfasst jedoch nicht die Dynamik der Tumorimmunentwicklung und ein großer Teil der Patienten spricht trotz ihres TMB-Status nicht auf Immuntherapien an. Darüber hinaus hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass auch kolorektale Karzinome mit niedrigem TMB eine klinische Reaktion auf ICIs erzielen können9. Die zunehmenden Belege für die Rolle der adaptiven Immunität bei der Gestaltung des Krebsgenoms40 und die Einschränkungen prädiktiver Biomarker für die ICI-Behandlung unterstreichen die Notwendigkeit genauer Messwerte, die die zugrunde liegende Tumorentwicklungsgeschichte widerspiegeln.

Hier schlagen wir vor, dass das auf dem Selbstimmunpeptidom geschätzte Verhältnis von nicht-synonymen zu synonymen Mutationen (dN/dS) verwendet werden kann, um zwischen immun-editierten und immun-entkommenen Tumoren zu unterscheiden und so eine Vorhersage des Behandlungserfolgs zu ermöglichen. Wir stellten die Hypothese auf, dass metastasierende Tumoren mit einem entwickelten Fluchtmechanismus Neoantigene ansammeln und dass ihre angesammelte Antigenität durch Immuntherapie entlarvt wird. Im Gegensatz dazu weisen immuneditierte Tumoren insgesamt eine geringe Tumorantigenität auf und reagieren weniger wahrscheinlich auf ICIs. Diese Hypothese wurde durch unsere Analyse der ICI-Reaktion bei mehr als 300 metastasierten Tumoren bestätigt. Unsere Ergebnisse zeigen die Bedeutung evolutionär bewusster Metriken gegenüber dem Standard-TMB als prädiktive Biomarker für die ICI-Behandlung.

Wichtig ist, dass wachsende Zellen während der Immuneditierung einer Immunselektion unterliegen. Allerdings war die negative Selektion bei Krebs ein kontroverses Thema28,29,41. Obwohl einige Studien einen Zusammenhang zwischen Immunaktivität und selektivem Druck gezeigt haben2,13,24,42,43, haben andere behauptet, dass es nur begrenzte Beweise für diesen Zusammenhang gibt28,44. Da in mehreren Studien dN/dS als Selektionsmaß bei Krebs und normalem Gewebe verwendet wurde13,14,45,46,47,48, wollten wir die Immun-dN/dS-Dynamik verstehen, um das Fehlen von Selektionssignalen bei Krebs zu erklären. Über die vorgeschlagenen Erklärungen hinaus zeigen wir, dass Immunselektionssignale verloren gehen, wenn es nicht gelingt, Individuen in bearbeitete und entkommene Personen zu klassifizieren. Die geringe Anzahl von Tumortypen mit starker Immunselektion lässt darauf schließen, dass die meisten über einen unentdeckten Immun-Escape-Mechanismus verfügen, der letztendlich mithilfe von Immun-dN/dS erkannt werden kann.

Welche Gene und genetischen Veränderungen genau zur Immunumgehung oder Immunerkennung führen, ist noch unbekannt. Escape- oder Antigenvariationen können in bestimmten Kontexten aufgrund anderer genetischer Ereignisse wie CN-Veränderungen27, Genfusionen49 oder Frameshift-Ereignissen50 auftreten. Die Entdeckung und Profilierung nichtkanonischer Transkripte, die von Viren oder abweichenden Spleißisoformen stammen, ist dank neuer Technologien (d. h. Long-Read-Sequenzierung) erst seit kurzem möglich. Darüber hinaus deutet das Fehlen einer Immunselektion bei Tumoren ohne genetische Flucht darauf hin, dass möglicherweise auch andere Mechanismen existieren, die die Umgehung nachahmen. Das heißt, Tumorklone in immunprivilegierten Geweben wachsen unter immunneutraler Dynamik. Eine weitere Einschränkung beim Nachweis der Immunselektion ergibt sich aus dem gewählten persönlichen Immunpeptidom; Keimbahnvarianten, Expressionsstatus, falsche MHC-Bindungsvorhersagen oder Mutationen, die die native Affinität verringern, können die Präzision der Immunselektion beeinträchtigen, d. h. vorhergesagte Immunpeptidome mit einem Überschuss an Peptiden, die nicht wirklich an MHC gebunden sind, maskieren Selektionssignale. All diese Einschränkungen machen die Immunselektionsmetriken äußerst konservativ und unterstreichen die dringende Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der natürlichen Immunität während der Tumorprogression.

Die weitere Verfeinerung des Immunpeptidoms und der Escape-Gene durch die Verbesserung der MHC-Bindungsvorhersagemethoden und die Bewertung der funktionellen Auswirkungen von Escape-Ereignissen sowie die Entdeckung nichtmenschlicher/alternativ abgeleiteter Antigene müssen Priorität haben, um alle möglichen und funktionellen Tumor-Immun-Wechselwirkungen aufzudecken Krebsentwicklung.

Somatische Mutationsanrufe von 10.202 Proben aus 33 Tumortypen vom TCGA-Konsortium wurden über das GDC-Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/) für vier Anrufer abgerufen: MuTect2, VarScan2, MuSE und SomaticSniper. Wir haben unsere Ergebnisse zwischen Anrufern verglichen und MuTect2 für alle verbleibenden Analysen verwendet. GDC verfügt über eine einheitliche Pipeline mit mehreren Qualitätskontrollen, einschließlich einer Reihe normaler Tests, um falsch positive somatische Anrufe51 (d. h. Keimbahnkontaminationen) herauszufiltern. MAF-Dateien wurden in VCFs konvertiert und mit ensemblVEP (v89) unter Verwendung der Option „flag –pick“ (bestes Ensembl-Transkript) neu kommentiert. Es wurden nur Punktmutationen berücksichtigt, die als Synonym-, Missense-, Start-Loss-, Stop-Gain-, Stop-Loss- oder Frameshift-Mutationen klassifiziert wurden.

Normalisierte Immunscores für mehrere Zellsubpopulationen wurden aus drei verschiedenen Studien erhalten (Rooney et al.26, Danaher et al.33 und Thorsson et al.34). Für die Kohortenanalyse wurden die mittleren Immunscores pro Tumortyp auf der Grundlage der verfügbaren Daten berechnet (z-normalisierte Scores, Zelltypscores basierend auf der Expression spezifischer Gene oder Thorsson-Immunexpressionscluster-Scores).

Als HBMRs und simulierte HBMRs definierte Immunselektionsmetriken stammen aus einer früheren Studie28 und sind für 19 Tumortypen verfügbar. Das Akronym CRC umfasst Proben von Kolonadenokarzinomen und Rektumkarzinomen.

Sechsstellige HLA-Allelinformationen für 9.736 Proben wurden aus den kontrollierten Zugriffsdateien von Thorsson et al.34 abgerufen, die alle unter https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/panimmune hinterlegt sind.

Expressions- und CN-Daten pro Gen wurden von der GDCquery-API heruntergeladen, die im R-Paket TCGAbiolinks verfügbar ist. Wir normalisierten die Expressionswerte, indem wir die oberen Quantilfragmente pro Kilobase Exon pro Million kartierter Fragmente (FPKM) pro Gen und Probe durch den in jeder Probe beobachteten Maximalwert dividierten und dann eine logarithmische Transformation anwendeten. Um anhand des CN-Status festzustellen, ob eine Person entkommen war, haben wir die mittlere Anzahl der Deletionen (CN = 1 oder CN = 0) und die mittlere Anzahl der Zuwächse (CN > 2) für eine Untergruppe von 1.097 Patienten mit CN-Status und Immunität geschätzt dN/dS vorhanden (mindestens auch 1). Personen mit über der mittleren Anzahl gelöschter Escape-Gene wurden als „entkommene Del“ klassifiziert. Ein ähnlicher Ansatz wurde für entgangene Gewinne verwendet.

Um den Einfluss von Missense-/Truncating-Ereignissen auf die CN-Belastung zu bestimmen, haben wir den Aneuploidie-Score für Deletionen und Amplifikationen aus der Ergänzungstabelle 2 in einem zuvor veröffentlichten Artikel erhalten35.

SOPRANO (http://github.com/luisgls/SOPRANO) wurde auf der Grundlage unserer ursprünglichen Methode erstellt, die in Zapata et al.13 veröffentlicht wurde, um die Auswahl in mit Varianteneffekt-Prädiktoren annotierten Dateien zu berechnen. Es berechnet das Verhältnis der nicht-synonymen zur synonymen Mutationsrate (dN/dS) innerhalb (ON-target dN/dS) und außerhalb (OFF-target dN/dS) einer Zielregion unter Verwendung einer 192-Trinukleotid-Kontextkorrektur (SSB192). SOPRANO benötigt zwei Eingabedateien: (1) eine mit Varianteneffekt-Prädiktoren annotierte Datei mit somatischen Punktmutationen und (2) eine Bettdatei mit Zielproteinkoordinaten. Missense und synonyme Mutationen müssen einbezogen werden. Andere Punktmutationen wie Trunkierung (Stop-Loss/Stop-Gain) oder Splicing-Varianten können als nicht-synonyme Ereignisse einbezogen werden. Die übrigen Mutationstypen werden verworfen, mit Ausnahme der intronischen Mutationen. SOPRANO kann intronische Mutationen nutzen, um die aus OFF-dN/dS-Regionen geschätzte Hintergrundmutationsrate zu verbessern, indem die beobachtete Anzahl intronischer Mutationen durch die Länge der intronischen Regionen des Gens (geschätzt aus dem hg19-Genom) dividiert wird. Die resultierende Mutationsrate wird dann mit OFF-dN/dS gemittelt.

SOPRANO kann dN/dS anhand somatischer Mutationsdaten eines einzelnen Patienten oder einer Kohorte in einer beliebigen Region von Interesse berechnen. SOPRANO ermöglicht den Ausschluss von Treibergenen und/oder die Randomisierung der Zielregion. SOPRANO verwendet eine Reihe von Ensembl-Transkript-Identifikatoren und ihre jeweilige FASTA-Datei und ermöglicht so die Schätzung von dN/dS in jedem Genom, unabhängig von der Version. Eine wesentliche Einschränkung von SOPRANO besteht darin, dass die Immunselektion nicht abgeschätzt werden kann, wenn im Immunpeptidom keine Mutationen vorhanden sind. In diesen Fällen ist eine Unterscheidung zwischen Immun-Editing und Escape nicht möglich.

In dieser Arbeit wurde die Immunselektion auf mehreren Ebenen geschätzt (beschrieben in Tabelle 1). Für die Kohortenanalyse verwendeten wir HLA-A0201- oder Proto-HLA-basierte Vorhersagen. Für eine patientenspezifische Analyse haben wir ein Selbstimmunpeptidom erstellt, das auf allen Peptiden basiert, von denen vorhergesagt wurde, dass sie mindestens eines der sechs HLA-Keimbahnallele als Zielregion binden. Wir haben Immun-dN/dS als das Verhältnis zwischen dN/dS innerhalb (ON-target dN/dS) und außerhalb des Immunpeptidoms (OFF-target dN/dS) definiert, um technische Artefakte (Keimbahnkontamination, Überfilterung oder falsch-positive somatische Aufrufe) zu korrigieren ), die den neutralen dN/dS beeinflussen können (~1). Immun-dN/dS ist eine normalisierte Metrik der Immunselektion unter der Annahme, dass die meisten kodierenden somatischen Mutationen außerhalb des Immunpeptidoms nicht antigen sind. Diese Annahme wird durch die Tatsache gestützt, dass nur 10 % der Missense-Mutationen zu Neoantigenen mit hoher Erkennungswahrscheinlichkeit führen; Daher sollte die Mehrheit der Mutationen außerhalb des Immunpeptidoms (mit Ausnahme der Treibergene) einer neutralen Dynamik unterliegen (dN/dS ~ 1). Wir haben verschiedene Immunpeptidome getestet und gezeigt, dass OFF-dN/dS unter mehreren Bedingungen ungefähr eins beträgt (ergänzende Abbildung 2).

Beispielsweise bedeutet ein Immun-dN/dS von 0,6, dass 40 % der nicht-synonymen Mutationen (na) entfernt wurden, bezogen auf die beobachtete Anzahl synonymer Ereignisse (ns), multipliziert mit dem Verhältnis der nicht-synonymen (μa) und synonymen Mutationsraten (μs). ) (Gleichung 1).

Mit dieser Formel können wir auch die Anzahl der durch Selektion entfernten Neoantigene im Immunpeptidom jedes Individuums berechnen, indem wir Folgendes verwenden:

wobei \(n_{a_{edited}}\) die Anzahl der aus dem Tumor entfernten nicht-synonymen Mutationen ist, basierend auf der beobachteten Anzahl nicht-synonymer Mutationen (\(n_{a_{obs}}\)) und der neutralen Erwartung (\( \frac{{\mu _a}}{{\mu _s}}\)) Diese Zahl stellt eine untere Grenze für die Anzahl der immuneditierten Mutationen dar, da Mutationen außerhalb des Immunpeptidoms möglicherweise auch durch Immunselektion (nicht synonym in) editiert wurden Nicht-Selbst-Regionen, die ein nicht-bindendes Peptid in ein bindendes Peptid umwandeln.

Um ein menschliches Immunpeptidom zu konstruieren, haben wir kodierende Transkripte mit HGNC-Symbol und Ensembl-Transkript-ID von Ensembl Biomart (Gene v90) heruntergeladen. Wir haben alle Transkriptlängen ermittelt und Bedtools (V2.26) makewindows ausgeführt, um alle möglichen überlappenden 9-mers zu erhalten. Anschließend haben wir die FASTA-Sequenz für jedes dieser 11.060.000 9-mer erhalten und netMHCpan4.0 (und netMHCpan4.1) unter Verwendung einer Liste von HLA-Allelen (4-stellige Auflösung für HLA-A, -B und -C) ausgeführt. Diese Liste wurde auf die 70 wichtigsten HLA-Allele beschränkt, die in einer Liste von 1.277 Proben aus der 1000 Genomes Project-Kohorte eine Populationshäufigkeit von mehr als 1 % aufweisen52. Wir haben alle möglichen Peptide mit einem %Rank < 0,5 (starke Bindungen oder SB) als unser ungefiltertes Immunpeptidom ausgewählt.

Um die Spezifität unserer Schätzungen zu erhöhen, haben wir den Datensatz gefiltert, indem wir starke Bindungspeptide mit einer Liste T-Zell-positiver Assay-Peptide aus der Immune Epitope Database, IEDB (http://iedb.org abgerufen am 05.02.2018) kreuzten. . Das Peptid wurde beibehalten, wenn die 9-mer-Sequenz eine exakte Übereinstimmung mit einem IEDB-positiven Peptid mit einer Länge von 9 oder mehr aufwies. Wir haben Transkripte mit einer mittleren und/oder mittleren Expression von mehr als 1 FPKM (global exprimierte Gene) aufbewahrt, berechnet über 33 TCGA-Tumortypen, die aus dem Human Protein Atlas stammen. Die Liste der starken Bindemittel, die sich mit IEDB-positiven Tests überschneiden, kann aus dem GitHub-Repository (github.com/luisgls/SOPRANO) als Bed-Datei abgerufen werden: allhlaBinders_exprmean1.IEDBpeps.bed. Um ein HLA-A0201-Immunpeptidom zu erhalten, filtern wir diese Liste nach Regionen, die mit HLA-A0201 assoziiert sind. Um ein Proto-HLA zu erhalten, haben wir die gleiche Filterung durchgeführt, jedoch für A0201, A0101, B0702, B0801, C0701 und C0702.

Um ein patientenspezifisches Immunpeptidom zu generieren, suchen wir mithilfe eines im Repository bereitgestellten Skripts in der vorberechneten Immunpeptidom-Datenbank (d. h. allhlaBinders_exprmean1.IEDBpeps.bed) nach den sechs passenden HLA-Allelen. Wir haben eine Bettdatei erstellt, die eine Ensembl-Transkript-ID sowie den Anfang und das Ende des zusammengeführten Satzes vorhergesagter HLA-bindender Peptide enthält.

Um SOPRANO zu vergleichen, berechneten wir ON, OFF und Immun-dN/dS unter Verwendung mehrerer Immunpeptidome (ergänzende Abbildung 2) aus einer zufälligen Gruppe von 1.000 HLA-A0201-Individuen. Wir verglichen starke Bindemittel, die mit netMHCpan4.0 oder netMHCpan4.1 vorhergesagt wurden (verfügbar im Github-Repository). Wir verglichen (a) starke Bindungen (%Rang <0,5 definiert) und (b) schwache Bindungen (%Rang <2 definiert als SB + WB, ergänzende Abbildung 2, Immunpeptidom C und E). Um den Einfluss der patientenspezifischen Expression zu bestimmen, wurden alle nicht exprimierten Transkripte (FPKM = 0) von jedem TCGA-Individuum entfernt (Gruppe C, E und G in ergänzender Abbildung 2).

Mit SOPRANO erhielten wir Kohorten- (Ergänzungstabelle 2) und pro Patient (Ergänzungstabelle 4) Immun-dN/dS für 33 Tumortypen. Wir haben Kohorten mit weniger als 10 Mutationen im Immunpeptidom ausgeschlossen und den ExonicIntronic-Modus und die SSB192-Korrekturmethode verwendet. Für die Analyse einzelner Personen verwendeten wir den ExonicOnly-Modus und behielten Personen mit mindestens einer einzigen synonymen Mutation im Immunpeptidom. Für die Korrelationsanalyse wurden die Pakete Ggpubr und ggstatsplot von R verwendet, die im Repository CRAN (29.02.2020) verfügbar sind. Wir haben SOPRANO für nicht entkommene Patienten durchgeführt, indem wir Tumore mit Missense- oder Trunkierungsmutationen in einem der als Escape-Gene gekennzeichneten Gene (gekennzeichnet als entkommenes +) ausgeschlossen haben.

Um das beste lineare Regressionsmodell zu ermitteln, überprüften wir die Kollinearität und verglichen Kohorten- und pro-Patient-SOPRANO ON, OFF und Immun-dN/dS (ON/OFF) von Tumoren mit verfügbaren Immuninfiltratdaten. Da dN/dS eine kontinuierliche Ergebnisvariable ist und unser Ziel darin bestand, herauszufinden, welche Immunmetriken mit unbekannten Zufallseffekten dN/dS erklären, verwendeten wir verallgemeinerte lineare gemischte Modelle. Wir haben mithilfe der Funktion „stepAIC“ das leistungsstärkste Modell ausgewählt und mithilfe des gvlma-Pakets auf Normalität und Heteroskedastizität überprüft. TMB wurde als Logarithmus zur Basis 10 der Punktmutationszahl definiert. Als TMB zum Modell hinzugefügt wurde, verstieß es gegen die Annahmen der linearen Regression. Wir verglichen die Expressionsniveaus von PD1 und PDL1 in einem univariaten und multivariaten Modell mit CD8-T-Zellen.

Wir haben eine Liste der Gene von der Antigen Processing and Presentation Machinery (hsa04612) erhalten, die von KEGG heruntergeladen wurde. Wir haben in Rosenthal et al.2 verwendete Escape-Gene einbezogen, die in dieser Liste nicht vorhanden waren, wie ERAP1, ERAP2, IRF1 und PDIA3. Wir haben auch FAS und MEX3B hinzugefügt, beides Gene, die mit der Immunantwort assoziiert sind53,54. Die endgültige Liste bestand aus 88 Genen (Ergänzungstabelle 4). Anschließend klassifizierten wir jedes Individuum als entkommen+, wenn in einem dieser Fluchtgene eine Missense- oder eine abschneidende Mutation vorlag. Um festzustellen, ob diese Gene in der TCGA-Kohorte einer positiven Selektion unterzogen wurden, haben wir dndscv14 mit Standardparametern ausgeführt und dabei nur Escape-Gene verwendet (Ergänzungstabelle 6).

Wir haben eine hochwertige Untergruppe von MSI-reichen Tumoren, CRC, UCEC und STAD erhalten. In diesem Datensatz waren kuratierte Daten für andere Escape-Mechanismen und den MSI-Status verfügbar (Lakatos et al.32). Wir haben diejenigen Patienten ausgeschlossen, denen kein Escape-Phänotyp oder kein molekularer Subtyp zugewiesen war (MSS, MSI oder POLE). Wir untersuchten auch CN-Veränderungen in Escape-Genen und bestimmten den Escape-Status des Patienten basierend auf der mittleren Anzahl der in jedem Tumortyp vorhandenen CNAs. Klonale und subklonale Mutationen für diese Patienten wurden aus unserer vorherigen Studie erhalten.

Die somatischen Anrufe und Metadaten von Hartwig wurden von der Hartwig Medical Foundation unter der Lizenzvereinbarung DR-078 bezogen. Wir wählten 308 metastasierte Patienten aus, die sich nach der Biopsie einer Immuntherapie unterzogen und in der Spalte „Erste Reaktion“ aus den Metadaten ein klinisches Ansprechen aufwiesen. Es wurden nur Mutationstypen einbezogen, die als Synonym, Missense, Start-Loss, Stop-Gain, Stop-Loss oder Frameshift klassifiziert wurden. Wir haben nur somatische Aufrufe mit dem Flag PASS verwendet, Indels entfernt und SNVs mit ensemblVEP (v90, Referenz Grch37) mit der Option –pick (bestes Transkript pro Gen) neu annotiert. Wir haben VATools V1.0.0 verwendet, um die Eingabe für SOPRANO zu analysieren.

Die klinischen Rohdaten wurden von HMF bereitgestellt und abschließende Konsistenzprüfungen müssen noch durchgeführt werden. Die Bewertung des Ansprechens wurde nicht im Rahmen einer klinischen Studie durchgeführt und der Zeitpunkt der Bewertungen war unterschiedlich. Die Patienten wurden basierend auf dem ersten nach Beginn der Behandlung aufgezeichneten Ansprechen anhand der RECIST1.1-Antwortkriterien in Ansprechende und Nichtansprechende eingeteilt. Bei den Respondern handelte es sich um alle Personen mit vollständigem Ansprechen (1 Fall) oder teilweisem Ansprechen (78 Fälle). Patienten mit stabiler Erkrankung (98 Fälle) oder fortschreitender Erkrankung (131 Fälle) wurden als Nonresponder eingestuft. Es gab 79 Patienten ohne Daten, von denen 2 als klinische Progression eingestuft wurden, 4 als nicht determiniert eingestuft wurden und 3 Fälle als nicht vollständiges Ansprechen/nicht fortschreitende Erkrankung eingestuft wurden und nicht in die Analyse einbezogen wurden. Der Zeitpunkt von der Biopsie bis zur Reaktion wurde nicht berücksichtigt. Es wurden keine weiteren Klassifizierungen durchgeführt. Wir verwendeten den gleichen Satz von 88 „Flucht“-Genen, um Patienten in „escaped+“ und „escaped−“ zu klassifizieren.

Aufgrund der Verfügbarkeit von Sequenzen des gesamten Genoms im HMF verwendeten wir MOBSTER20, um eine klonale/subklonale Dekonvolution durchzuführen und den klonalen versus subklonalen Status somatischer Mutationen zu bestimmen. Wir schlossen Mutationen mit VAF > 8 % ein und gingen von den klonalen CN-Zuständen 1:0, 1:1, 2:0, 2:1 und 2:2 aus. Die restlichen Parameter waren Standard.

Wir haben 308 Keimbahn-Genomsequenzierungsdaten entweder im FASTQ- oder CRAM-Dateiformat aus dem Google Cloud-Bucket erhalten. CRAM-Dateien wurden mit samtools (v1.11) vorverarbeitet, um sie in Fastq-Dateien zu konvertieren. Fastq-Dateien wurden mithilfe von Yara Mapper55 anhand einer Standard-HLA-Referenz auf das Genom abgeglichen, wodurch die Eingabe für OptiType56 generiert wurde, um für jeden Patienten einen 4-stelligen HLA-Typ zu erhalten. Die Referenzen basieren auf der IMGT/HLA-Version 3.14.0, Juli 2013, und wurden wie in der Veröffentlichung von OptiType beschrieben verarbeitet.

Um eine Überlebensanalyse in der HMF-Kohorte durchzuführen, verwendeten wir die Differenz zwischen dem Biopsiedatum und dem Sterbedatum, um die Zeitvariable für die verstorbenen Patienten zu erhalten. Bei Patienten, die als lebend eingestuft wurden, haben wir das letzte in der Kohorte erfasste Datum als maximales Datum vom Biopsiedatum abgezogen. Patienten wurden als lebend eingestuft, wenn in den klinischen Metadaten kein Sterbedatum verzeichnet war. Neutrale Personen waren Personen mit einem Immun-dN/dS-Wert zwischen 1,22 und dem Kehrwert von 0,82, basierend auf dem oberen Quartil des Immun-dN/dS-Werts. Diese Werte stimmen mit der Analyse überein, die in der Kohorte mit Längsmetastasen durchgeführt wurde. Wir untersuchten auch den Zusammenhang zwischen d-immunem dN/dS, definiert als der absolute Abstand zu eins, und dem Gesamtüberleben.

Um Treiber, Escape und globales dN/dS zu bestimmen, haben wir SSB192 (http://github.com/luisgls/SSB-dNdS) mit Standardparametern für jede Untergruppe der HMF-Kohorte ausgeführt. Wir haben den Treiber-dN/dS anhand der Liste von 196 Genen berechnet, die in Martincorena et al.14 bereitgestellt wurden. Wir haben Escape dN/dS anhand der Liste von 88 Genen berechnet, die in dieser Studie verwendet wurden. Globaler dN/dS sind die dN/dS-Werte im gesamten Exom unter Berücksichtigung aller Punktmutationen. Immunopeptidom dN/dS ist der von SOPRANO erhaltene Wert.

Statistische Tests wurden mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests für zwei Verteilungen oder des Kruskal-Wallis-Tests, wenn mehr als zwei Verteilungen vorhanden waren, unter Verwendung des R-Pakets ggstatsplot durchgeführt, sofern in der Arbeit nicht ausdrücklich angegeben. Mit Bonferroni wurde eine Mehrfachtestkorrektur für die univariate Coxph-Analyse durchgeführt. Für die Überlebensanalyse haben wir das Paket ggsurv verwendet und mehrere Testkorrekturen für paarweise Vergleiche unter Verwendung von Benjamini-Hochberg angewendet, sofern nicht anders angegeben.

Die somatischen Mutationsdaten haben wir von Riaz et al.39 erhalten, einer Melanomkohorte, die vor und während der Immuntherapie sequenziert wurde. Die RECIST1.1-Klassifizierung und die klinischen Ergebnisse wurden von den Autoren bereitgestellt. Wir haben SOPRANO (github.com/luisgls/SOPRANO) ON, OFF und Immun-dN/dS mithilfe eines patientenspezifischen Immunpeptidoms erhalten, das aus Peptiden besteht, von denen vorhergesagt wird, dass sie das native MHC (sechs HLA-Allele) binden. Wir klassifizierten Personen basierend auf ihrem Immun-dN/dS als niedrig (<0,82), neutral (0,82–1,21) oder hoch (>1,21).

Wir verwendeten den gleichen Satz von 88 Escape-Genen aus der vorherigen Analyse, um Patienten basierend auf dem Vorhandensein von Stop-Loss-, Frameshift-, Stop-Gain-, Start-Loss- und Missense-Mutationen in Escaped+ und Escaped− zu klassifizieren. Darüber hinaus klassifizierten wir Patienten als entkommen+, wenn sie einen Verlust der Heterozygotie aufwiesen oder in der HLA-Region vollständig homozygot waren. Für die abschließende Kohortenanalyse haben wir 48 Patienten ausgewählt, die weltweit mehr als 10 Mutationen, mindestens eine synonyme Mutation im Immunpeptidom und Daten zum klinischen Ansprechen aufwiesen.

Wir haben den statistischen Vergleich zwischen dN/dS-Verteilungen von Proben vor (Pre) und Post-(On) Behandlung mithilfe des Wilcoxon Mann-Whitney-Tests durchgeführt. Für die Kohortenanalyse haben wir alle Proben für jede Schicht gemischt und den Immun-dN/dS basierend auf den beobachteten Zahlen nicht-synonymer und synonymer Mutationen und Standorte neu berechnet. Um zu bestätigen, dass der Immun-dN/dS der Non-Responder-Escape-Gruppe kein Artefakt aus der Auswahl der Escape-Gene war, haben wir 10.000 Mal 42 Gene (entspricht der Anzahl der mutierten Gene in unserer Liste von 88 Genen) aus allen Genen und dN/dS für jede der vier Gruppen (NR−, NR+, R−, R+) neu berechnet. Wir verglichen die mittlere Schätzung der beobachteten Kohorte (NR−) mit der randomisierten Verteilung von dN/dS für NR−.

Für die Überlebensanalyse führten wir zunächst eine Cox-Regression für TMB und Immun-dN/dS durch. Um einen optimalen Cutpoint auszuwählen, haben wir die Funktion surv_cutpoint aus dem R-Paket survminer verwendet. Mit dieser Funktion konnten wir numerische Variablen in kategoriale Variablen für TMB und Immun-dN/dS unterteilen. In unserer ersten Klassifikation der Immunkategorien haben wir 0,82 als maximalen Grenzwert für immungeschwächte Patienten und den Kehrwert 1,21 als Mindestwert für immungeschwächte Patienten verwendet. Wir haben die Größe der Konfidenzintervalle für jeden Patienten mit dem Immun-dN/dS verglichen. Um nur immunneutrale und immuneditierte Patienten zu vergleichen, wurden Proben mit hohen Konfidenzintervallen (KI > 5) und einem Immun-dN/dS von mehr als 1,21 für die Überlebensanalyse gefiltert. P-Werte wurden mit der Funktion ggsurvplot aus dem R-Paket ggsurv ermittelt.

Wir haben unser frei verfügbares Paket (https://github.com/luisgls/dNdSSimulator) verwendet, um Immun-dN/dS unter zwei extremen Bedingungen zu simulieren: vollständig aktives Immunsystem und keine Fähigkeit zur Immunantwort (Parameter „pattack“ auf 1 gegenüber 0 gesetzt). ). Eine detaillierte Beschreibung zur Ausführung des Simulators finden Sie auf der Website. In jeder Bedingung haben wir 1.000 Tumore simuliert, beginnend mit einem anfänglichen Pool von fünf Zellen, einer Wahrscheinlichkeit der Immunerkennung von 10 % (1 von 10 Neoantigenen wird bei jeder Zellteilung mit einer auf „pattack“ eingestellten Wahrscheinlichkeit erkannt). Simulationen wurden bis zur 100. Generation durchgeführt, es sei denn, sie erreichten zuvor die Tragfähigkeit (Anzahl der Zellen > 2.000). In jeder Simulation wurden zum letzten Zeitpunkt die Populationsgröße und die Anzahl der nicht-synonymen/synonymen Mutationen im Immunpeptidom aufgezeichnet und Mutationen, die in weniger als 1 % der Zellen vorhanden waren, wurden verworfen. Zur Schätzung des Immun-dN/dS wurden nur Simulationen mit mehr als 1.000 Zellen verwendet und die Ergebnisse wurden in das GitHub-Repository (dNdSSimulator) hochgeladen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

TCGA-Daten wurden vom GDC-Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/) bezogen und wie zuvor beschrieben verarbeitet21. HBMR-Selektionswerte im Immunpeptidom wurden aus dem ergänzenden Material von Van Den Eynden et al.28 erhalten. Normalisierte Werte für die Infiltration von Immunzellen wurden von Rooney et al.26, Danaher et al.33 und Thorsson et al.34 erhalten. Gene, die an der Antigen-präsentierenden Maschinerie beteiligt sind, wurden vom KEGG-Signalweg hsa04612 (https://www.genome.jp/pathway/hsa04612) erhalten. Eine zusammengestellte Liste von Fluchtmechanismen für Kolonadenokarzinome, Rektumadenokarzinome sowie STAD und UCEC wurde von Lakatos et al.32 erhalten. Somatische Variantenaufrufe von 308 Proben der Hartwig Medical Foundation wurden vom Hartwig Data Portal unter der Lizenzvereinbarung DR-075 (https://database.hartwigmedicalfoundation.nl/) heruntergeladen. Genomweite Keimbahn- und somatische Daten auf Patientenebene der Hartwig Medical Foundation (BAM-Rohdateien und annotierte Variantenaufrufdaten) gelten als datenschutzrelevant und sind über einen zugriffskontrollierten Mechanismus verfügbar. Somatische Anrufe, klinische und HLA-Allelinformationen von 68 Patienten mit metastasierender Erkrankung, die vor und während der immuntherapeutischen Behandlung sequenziert wurden, wurden von den Autoren von Riaz et al.39 erhalten und in Zenodo hinterlegt (https://doi.org/10.5281/zenodo.7546705). . SOPRANO-Ergebnisse für jeden Tumortyp und Patienten sind als Zusatztabellen verfügbar. Analysierte Daten, Code und R-Markdown-Dateien zur Reproduktion von Rohzahlen wurden in Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7416627) zur Verfügung gestellt.

SOPRANO ist unter github.com/luisgls/SOPRANO frei verfügbar. Der Simulator des stochastischen Verzweigungsprozesses für das Immunediting ist unter http://github.com/luisgls/dNdSSimulator verfügbar. Auf den Code zur Schätzung der positiven Selektion in Escape-Genen kann unter https://github.com/im3sanger/dndscv zugegriffen werden. Code zur Schätzung von Treiber-, Global- und Treiber-dN/dS kann unter http://github.com/luisgls/SSB_selection abgerufen werden. Wir haben die Programmiersprache R (Umgebung 3.63, 29.02.2020) und Standard-R-Pakete verwendet, die in Repositories wie CRAN (29.02.2020) und Bioconductor 3.12 verfügbar sind. Für Rohzahlen benötigte Code- und R-Pakete sind als R-Markdown-Dateien verfügbar (https://doi.org/10.5281/zenodo.7416627). Damit SOPRANO funktioniert, werden Bedtools 2.26 und R benötigt. Um Eingabedateien für SOPRANO zu generieren, wurde ensemblVEP v89 verwendet. Die für diese Veröffentlichung erstellte/verwendete Software wird im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben. Das Tutorial zum Ausführen von SOPRANO ist unter http://github.com/luisgls/SOPRANO verfügbar. Samtools (v1.11) wurde zum Konvertieren von Fastq-Dateien verwendet. Für die Lesezuordnung wurde Yara Mapper (https://www.seqan.de/apps/yara.html) verwendet. OptiType v1.3.3 wurde verwendet, um HLA-Allele zu erhalten. Die Referenzen basieren auf der IMGT/HLA-Version 3.14.0, Juli 2013. netMHCpan4.0 und 4.1 wurden zur Vorhersage der MHC-Bindung verwendet.

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Siragusa, E., Weese, D. & Reinert, K. Schnelle und genaue Lesezuordnung mit ungefähren Seeds und mehrfachem Backtracking. Nukleinsäuren Res. 41, e78 (2013).

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Szolek, A. et al. OptiType: Präzise HLA-Typisierung anhand von Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. Bioinformatik 30, 3310–3316 (2014).

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Referenzen herunterladen

LZ wird vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Forschungsstipendienprogramms (846614) unterstützt. AS und TAG werden vom Wellcome Trust (202778/B/16/Z bzw. 202778/Z/16/Z) und Cancer Research UK (A22909 an AS, A19771 und DRCNPG-May21_100001 an TAG) unterstützt. Wir danken AS und TAG für die Finanzierung durch das National Institute of Health (National Cancer Institute Grant U54 CA217376). Diese Arbeit wurde auch durch einen Wellcome Trust Award an das Center for Evolution and Cancer (105104/Z/14/Z) und von a unterstützt AIRC/CRUK/FC Accelerator Award an AS (CRUK: A26815, AIRC: 2279). Wir danken M. Punta und C.-A. Garin für Unterstützung und Diskussion. Wir danken S. Quesada und E. Ghorani für wichtige Einblicke in das Projekt. Diese Veröffentlichung und die zugrunde liegende Studie wurden teilweise auf der Grundlage der Daten ermöglicht, die die Hartwig Medical Foundation und das Center of Personalized Cancer Treatment der Studie zur Verfügung gestellt haben. Die Abbildungen 1 und 5a wurden mit Biorender.com erstellt. GC dankt der AIRC für die Finanzierung im Rahmen der MFAG 2020-ID. 24913 Projekt – PI Caravagna Giulio.

Zentrum für Evolution und Krebs, Institut für Krebsforschung, London, Großbritannien

Luis Zapata, Giulio Caravagna, Khalid AbdulJabbar, Chela James, Trevor A. Graham und Andrea Sottoriva

Cancer Data Science Laboratory, Fakultät für Mathematik und Geowissenschaften, Universität Triest, Triest, Italien

Giulio Caravagna

Computeronkologie, Abteilung für Epidemiologie und Biostatistik, Memorial Sloan 10 Kettering Cancer Center, New York, NY, USA

Marc J. Williams

Zentrum für Genomik und Computerbiologie, Barts Cancer Institute, Barts und die London School of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London, London, Großbritannien

Eszter Lakatos, Benjamin Werner und Trevor A. Graham

Das Marc und Jennifer Lipschultz Precision Immunology Institute, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Diego Chowell

Abteilung für Onkologische Wissenschaften, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Diego Chowell

Forschungszentrum für Computational Biology, Human Technopole, Mailand, Italien

Chela James, Salvatore Milite & Andrea Sottoriva

UCL Genetics Institute, Abteilung für Genetik, Evolution und Umwelt, University College London, London, Großbritannien

Lucie Gourmet

Abteilung für Biowissenschaften, Technische Universität des Nahen Ostens, Universiteler Mah, Ankara, Türkei

Ahmet Acar

Abteilung für Radioonkologie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA

Nadeem Riaz

Zentrum für Immuntherapie und Präzisions-Immunonkologie, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA

Timothy A. Chan

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LZ konzipierte, gestaltete, implementierte und führte alle Analysen durch. GC, MJW, EL, AA und BW unterstützten die Analyse. KAJ, DC, CJ, LG und SM leisteten bioinformatische Unterstützung. DC, TAC und NR generierten Sequenzierungsdaten und Probeninformationen für die Melanomkohorte. TAG und AS betreuten das Projekt. LZ hat den ersten Entwurf des Papiers geschrieben. LZ, AS und TAG haben mit Hilfe aller Autoren die endgültige Fassung des Papiers verfasst.

Korrespondenz mit Luis Zapata, Trevor A. Graham oder Andrea Sottoriva.

TAC ist Mitbegründer von Gritstone Oncology und hält Anteile. TAC hält Anteile an An2H. TAC dankt für Zuschüsse von Bristol Myers Squibb, AstraZeneca, Illumina, Pfizer, An2H und Eisai. TAC war als Berater für Bristol Myers, MedImmune, Squibb, Illumina, Eisai, AstraZeneca und An2H tätig. TAC und DC sind Inhaber des geistigen Eigentums an der Nutzung der Tumormutationslast zur Vorhersage des Ansprechens auf eine Immuntherapie. Das Patent wurde an PGDx lizenziert. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Genetics dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Abbildungen. 1–16.

Ergänzungstabellen 1–6,

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zapata, L., Caravagna, G., Williams, MJ et al. Die Immunselektion bestimmt die Tumorantigenität und beeinflusst die Reaktion auf Checkpoint-Inhibitoren. Nat Genet 55, 451–460 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01313-1

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Eingegangen: 27. Oktober 2021

Angenommen: 25. Januar 2023

Veröffentlicht: 09. März 2023

Ausgabedatum: März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01313-1

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